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发信人: Purple (◎紫藕轩◎小酌◎), 信区: Campus_Huajiachi
标  题: PCR-SSCP的发展现状
发信站: 浙江大学海纳百川站 (Sun Apr 20 00:07:03 2003)

PCR-SSCP的发展现状

随着分子生物学技术的发展,检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问 世以
后,各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR产物的
直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage,RNAase)、限制性 片段长度多态
性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)等等已成 为基因分析的有力
工具.但这些方法操作比较繁琐,局限性较大,或要求实验条件 高,不适合一般临床实验
室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法,经不断地改进和
完善,更为简便、快速、灵敏,不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入,而且还
被用于DNA定量分析,监测PCR诊断实验中的交叉污 染情况,以及传染源的调查等.由于SS
CP的突出的优点,近几年被大量地应用.
一、SSCP的原理及特点
  日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由
 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或 少
地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶
中受排阻大小不同.因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常 敏锐地将构
象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformatio
n Polymorphism,SSCP)分析.在随后的研究中,作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基
因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基
本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增 产物变性,而后快速复性,使之成为具有
一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后
通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的
相比发生改变,就可以判定该链构 象发生改变,进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法
简便、快速、灵敏,不需要特 殊的仪器,适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如,
只能作为一种突变检测方 法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;电泳条件要
求较严格;另外,由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构
象的改变来实现电泳分离的,这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体
构象的改变不起作用或作用很小 时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法
分辨造成漏检.尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先,它可以发现靶D
NA片段中未知位置的碱 基突变.Takao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,
90%可被SSCP发 现,他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外
,SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离,并且还可以进
一步 提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.
二、SSCP的不断改进
  SSCP技术自创立以来,经历了自身发展和完善的过程,刚建立时是将同位素掺入PCR
扩增物中,通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难,随着DNA 银染
方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化. 最近,
SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析,改为RNA-SSCP分析,其基本原理是: RNA有着更多
精细的二级和三级构象,这些构象对单个碱基的突变很敏感,从而提高 了检出率,其突变
检出率可达90%以上.另外,RNA不易结合成双链,因此可以较大量 的进行电泳,有利于用
溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较 长的引物,内含有启动RNA
聚合酶的启动序列,从而相对地增加了该方法的难度.
  为了进一步提高SSCP的检出率,可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂
交双链分析(Heterocluplex analysis,Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用 探针
与要检测的单链DNA或RNA进行杂交,含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交
链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点
突变的检出率接近100%,而且实验简便.
三、PCR-SSCP的实验操作
  在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)
1Kb~700b 3.5
700b~500b 5
500b~200b 8
200b 12
  在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

  1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)
  按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使
 模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之
凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1×TBE封闭,备用.
  2)电泳
  取10μlPCR产物,加入10μl变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30μ
l 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下
电泳.开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含 0.5ug/ml
溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染.
  3)银染法
  将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗
二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲
醛溶液中显色7min.最后,用0.75%NaCO3终止显色.
四、SSCP的应用
  自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来,该方法大量地用于检测和肿瘤发生
 有关的基因突变,例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p5
3基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法,成功地检测 了c-Ki
-ras2基因第12位的突变,电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检 测引起人类
遗传性疾病的研究上,如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族
性结肠息肉基因的研究中.最近,Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名B 型血友病患者的凝
血因子IX的基因序列,并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比 较,发现在全长2.6kbp的
凝血因子IX基因组中,有20处碱基点突变,RNA-SSCP可检测 出其中的70%,而DNA-SSCP只
能检测出35%,显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏 性.
  SSCP法除大量地用于基因突变的检测外,还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染
情况、以及病原体传播途径的研究中.Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行
了检测,并对扩增产物进行了SSCP分析,发现每个标本的SSCP图谱完全不同,不 仅证明了
HBVDNA具有地区性变异,而且排除了交叉性污染的可能性,为保证PCR诊断 结果的可靠性
找到了好方法.另外,Yap等还将SSCP用于DNA定量分析上,他们将SSCP 与竞争性PCR法相结
合进行乳腺癌细胞突变p53基因的定量分析,并取得了初步成功. 该方法的优点在于,内标
和待测DNA只有一个碱基不同,这样使内标和待测DNA有相同 的扩增条件,从而更准确地测
出DNA的量.从以上可以看出,SSCP正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用.
五、SSCP注意的事项
  SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法,为了使SSCP达到最佳效果,应
 注意下列事项.
  ①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变, S
SCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带,但有时有的DNA片段 可能只
呈现一条SSDNA带,或者三条以上,这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 立体构象.
有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.
  ②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链
的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小
的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下,DNA的长度不会影响SSCP 的效果.
他们仔细选择了实验条件,发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.
  ③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象,SSCP应在较低温
 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度 升高
的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较 高的电压
(250V),以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象
的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在
实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
  ④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的
影响,取决于该位置对维持立体构象作用的大小,而不是仅仅取决于点突变在DNA链 上的
位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾 设计了一
组样品DNA片段,并将其中的点突变设在DNA链的中部,而且该点又正处在发 夹结构顶端的
环上,结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%),说明 DNA链中任何部位的
突变,只要对其单链立体构象没有影响,都有可能被漏检.
  ⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量
的大小来分离的,而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的,因 此,这
种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近,很难 看出两者之
间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上,以检测限为指标来判 定结果.检测限是
指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移
率有改变,说明该DNA序列有变化,小于检测限则说明链之间无 变化.例如,一般检测限定
为3mm,那么当两带间距离在3mm以上,则说明两链之间有 改变.另外检测限不能定的太低
,否则主观因素太大,易造成假阳性结果.另外,SSCP 分析中其它条件,如PCR产物的上样
量,PAG的交联度、以及胶的浓度等,都应根据具 体实验进行选择确定.总之,SSCP分析法
是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法, 适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突
变,短核苷酸序列的缺失或插入.随着 SSCP分析不断完善,它将成为基因诊断研究的一个
有力工具.


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  花间一壶酒,独酌无相亲。举杯邀明月,对影成三人。


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众里寻她千百度,蓦然回首,那人依旧对我不屑一顾。